La evaluación de la interacción directa entre patógenos y receptores inmunitarios suele implicar técnicas sofisticadas o el uso de cepas transgénicas y células modificadas genéticamente. En este trabajo, se describe un método alternativo para detectar la interacción bioquímica entre el sensor microbiano de macrófagos SLAMF1 y Mycobacterium tuberculosis. Se desarrollaron dos enfoques técnicos que emplean citometría de flujo y microscopía de fluorescencia. Se generaron extractos de proteínas celulares totales de macrófagos humanos, que luego se incubaron con células completas de M. tuberculosis (WCMtb) o antígenos de M. tuberculosis (Ag Mtb) durante la noche a 4 °C y finalmente se entrecruzaron mediante un tratamiento con formaldehído/glicina/etilenglicol bis (succinimidil succinato). La interacción de SLAMF1 con WCMtb mediante citometría de flujo se detectó con un anticuerpo anti-SLAMF1 PE. La existencia de interacción mediante microscopía de fluorescencia se determinó mediante la fijación de Ags de Mtb teñidos con rodamina-PE a cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina, que se incubaron con el extracto proteico total de macrófagos derivados de monocitos. Tras el tratamiento de entrecruzamiento, se visualizó SLAMF1 mediante anticuerpos primarios (anti-SLAMF1) y secundarios (Alexa Fluor 488). Los ensayos proporcionaron una sólida herramienta bioquímica para medir las interacciones patógeno-inmunorreceptor, superando las dificultades asociadas con las líneas celulares transgénicas y los experimentos de modulación de la expresión génica de proteínas.
The evaluation of direct interaction between pathogens and immune receptors
usually involves sophisticated techniques or implies the use of transgenic strains
and genetically engineered cells. Here, an alternative method to detect biochemical
interaction between the macrophage microbial sensor SLAMF1 and Mycobacterium
tuberculosis is described. Two technical approaches employing flow cytometry
and fluorescence microscopy were developed. Total cell protein extracts from
human macrophages were generated, then incubated with whole cells of M.
tuberculosis (WCMtb) or M. tuberculosis antigens (Mtb Ags) overnight at 4 °C
and finally cross-linked using formaldehyde/glycine/ethylene glycol bis (succinimidyl
succinate) treatment. SLAMF1 interaction with WCMtb by flow cytometry was
detected with a PE-specific anti-SLAMF1 antibody. The existence of interaction by
fluorescence microscopy was performed by attaching Rhodamine-PE stained Mtb Ags
to poly-D-lysine coated slides, which were incubated with the total protein extract
from monocyte-derived macrophages. After cross-linking treatment, SLAMF1 was
visualized using primary (anti-SLAMF1) and secondary (Alexa Fluor 488) antibodies.
The assays provided a strong biochemical tool to measure pathogen-immunoreceptor
interactions, overcoming the difficulties associated with transgenic cell lines and
protein gene expression modulation experiments.
