Optimización de técnicas de regeneración in vitro y transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens en Lotus tenuis

Abstract

Lotus tenuis es una leguminosa forrajera de importancia en suelos con limitantes edafoclimáticas como la salinidad y los anegamientos transitorios, característicos de la Pampa Deprimida. Para favorecer la cría de ganado en estos suelos es necesario disponer de cultivares de alta productividad con tolerancia incrementada a estreses abióticos, lo cual se puede alcanzar con el apoyo de herramientas biotecnológicas. Por su importancia, L. tenuis constituye una especie atractiva para implementar la técnica de edición génica. Sin embargo, para poder aplicarla, es necesario contar con protocolos de transformación genética que garanticen altas frecuencias de regeneración in vitro y transferencia de ADN. La regeneración in vitro puede estar influenciada por diversos factores, como el genotipo y el ambiente, mientras que la eficiencia de la transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens depende, en gran medida, de la cepa utilizada. El objetivo de este trabajo fue optimizar técnicas de regeneración in vitro y transformación mediada por A. tumefaciens en L. tenuis a fin de que puedan ser utilizadas para realizar edición génica. Para esto, en una primera etapa, se comparó la capacidad de regeneración y elongación de tallos in vitro de cinco genotipos de diversos orígenes utilizando folíolos como explante: uno del cultivar Esmeralda de la empresa Gentos (E3), tres del cultivar Pampa INTA (P1, P2, PWt) y uno de una familia de medios hermanos del programa de Mejoramiento Genético de INTA EEA Pergamino (2297). Se determinó el porcentaje de regeneración hasta los 91 días de ensayo, el área regenerada a los 63 días de ensayo y el número y altura de tallos/explante (mm) a los 100 días de ensayo y a los 60 días del pasaje de los explantes a medio MS 0,5X. Se analizaron los datos mediante ANOVA o prueba de Kruskall Wallis y pruebas de comparaciones múltiples. Los genotipos que alcanzaron mayor regeneración en menor tiempo fueron 2297 y PWt (p<0,05), que a su vez presentó mayor número de tallos y mayor altura, en conjunto con P1. Considerando estos resultados se escogió al genotipo PWt para, en una segunda etapa, comparar con la misma metodología, su capacidad de regeneración y elongación de tallos in vitro en tres ambientes: invernáculo, sala de crecimiento e in vitro. Se determinó el porcentaje de regeneración hasta los 56 días de ensayo, el área regenerada a los 32 días de ensayo y el número y altura de tallos/explante (mm) a los 64 días y a los 60 días del pasaje de los explantes a medio MS 0,5X. Nuevamente, se analizaron los datos mediante ANOVA o prueba de Kruskall Wallis, 5

y pruebas de comparaciones múltiples. Los folíolos provenientes de plantas in vitro se destacaron para las variables evaluadas (p<0,05), por lo que se utilizaron en una última etapa para comparar la eficiencia de transferencia de ADN de cuatro cepas de A. tumefaciens (AGL1, EHA105, GV3101 y LBA4404). Para esto se utilizó el plásmido pCambia2301 que permite la expresión del gen reportero gusA. En primera instancia, se llevó a cabo la transformación de las cepas AGL1, EHA105 y LBA4404 utilizando el vector pCambia2301, mientras que la cepa GV3101 portadora del plásmido fue cedida por el Instituto de Genética “Ewald A. Favret”. La presencia del plásmido se confirmó mediante PCR para el gen de selección nptII y el gen reportero gusA. Folíolos de PWt se agitaron en suspensiones bacterianas competentes, siguiendo un protocolo publicado en bibliografía. La transformación se repitió cinco veces por cepa y se determinó el porcentaje de folíolos con expresión transitoria a los 4 días mediante observación bajo la lupa (10X), considerando positivos a aquellos con coloración azul. Se realizó ANOVA y prueba de comparaciones múltiples. La cepa LBA4404 no presentó folíolos positivos. El porcentaje de expresión transitoria utilizando GV3101 (45,3 % ± 3,3) resultó similar al de AGL1 (49,6 % ± 3,2) y menor al de EHA105 (79,6 % ± 2,7). Por lo tanto, la cepa EHA105 resultó más eficiente en la transferencia de T-DNA. La expresión transitoria se correlacionó con la resistencia de los explantes al agente selectivo kanamicina a los 60 y 90 días post-transformación. Este trabajo permitió establecer un protocolo eficiente para la transformación de folíolos de L. tenuis, provenientes del genotipo PWt cultivado en condiciones in vitro, utilizando la cepa EHA105 de A. tumefaciens. Se logró una eficiencia de transformación transitoria cercana al 80 %, lo cual representa un avance significativo para poder realizar edición génica en esta especie.