Eje intestino-pulmón: Impacto de la disbiosis intestinal y de la infección por Clostridioides difficile sobre la endocitosis de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

En los últimos años, ha crecido el interés del eje intestino-pulmón en el mantenimiento de la homeostasis inmunitaria. Este eje implica una regulación cruzada entre la microbiota intestinal y la pulmonar, impactando a su vez sobre el sistema inmune. En este trabajo final de grado comenzamos a explorar el eje intestino-pulmón en el contexto de dos infecciones bacterianas de relevancia epidemiológica: la Tuberculosis y la infección por Clostridioides difficile (CDI). La Tuberculosis se remonta a tiempos ancestrales, pero no constituye un problema del pasado ya que millones de personas contraen la infección y mueren de Tuberculosis cada año. Por su parte, la CDI es la causa más común de diarrea infecciosa nosocomial y generalmente se desarrolla luego del uso de antibióticos que provocan disbiosis de la microbiota intestinal. Teniendo en cuenta que la disbiosis intestinal ha sido implicada en numerosas infecciones respiratorias, que puede alterar la función del sistema inmune en sitios distales y favorecer el desarrollo de microorganismos patogénicos como C. difficile, consideramos que el estado del microbioma podría ser un factor importante en el desarrollo de la infección por Mycobacterium tuberculosis. En este trabajo abordamos 3 objetivos principales que incluyeron el análisis de pacientes y el uso de modelos in vitro e in vivo con el fin de evaluar el impacto de la disbiosis intestinal y de la CDI en la estructura del pulmón y la función endocítica de los macrófagos frente a M. tuberculosis. En primer lugar, hemos caracterizado clínica y demográficamente una población de 249 pacientes con sospecha de CDI provenientes de distintos centros de salud del Noroeste de la provincia de Buenos Aires. Los reportes epidemiológicos de la CDI en Argentina son escasos y heterogéneos. Con el desarrollo de este objetivo encontramos que el 21.29% de los pacientes con diarrea presentaban a C. difficile como agente causal y que más del 80% de los casos estaban infectados con cepas toxigénicas. Además, determinamos factores de riesgo y los comparamos con los reportados en otras poblaciones alrededor del mundo mediante un meta-análisis. Tanto la edad avanzada (más de 67 años), como la utilización previa de antibióticos, la hospitalización previa y episodios previos de CDI pueden ser considerados como factores de riesgo en nuestra cohorte de estudio. Más aun, parámetros sanguíneos como un número elevado de leucocitos y plaquetas, un recuento disminuido de basófilos y una concentración incrementada de urea podrían ser implementados como nuevos indicadores de CDI. Como resultado del meta-análisis realizado con 40 estudios independientes, pudimos determinar parámetros que coinciden a nivel global con nuestro estudio, destacándose la edad avanzada, el consumo previo de antibióticos y la internación previa como predictores de riesgo y el recuento leucocitario como indicador de la CDI. En segunda instancia, se realizaron ensayos in vitro en macrófagos derivados de monocitos obtenidos de dadores sanos, los cuales fueron pre - entrenados con C. difficile, y posteriormente desafiados con M. tuberculosis. Se evaluó la capacidad endocítica, así como la viabilidad y expresión de SLAMF1, un sensor microbiológico de M. tuberculosis. La finalidad de este objetivo fue realizar un primer acercamiento al entendimiento de cómo la infección intestinal por C. difficile puede impactar en la respuesta de los macrófagos durante la Tuberculosis. Logramos la puesta a punto del modelo de entrenamiento de los macrófagos con C. difficile y encontramos que la endocitosis de esta bacteria se mantiene estable a través del tiempo (niveles similares de internalización al día 1, 2, 5 y 7 de exposición a C. difficile). Sin embargo, luego del entrenamiento, la capacidad endocítica frente a M. tuberculosis cambia. Por un lado, la internalización exclusiva de M. tuberculosis (células que solo endocitan a M. tuberculosis) aumenta cuando los macrófagos se expusieron por tiempos prolongados a C. difficile, indicando una especialización de la función endocítica. Por el otro, la internalización de M. tuberculosis se reduce cuando los macrófagos entrenados con C. difficile se enfrentan a M. tuberculosis por tiempos más prolongados. También encontramos que C. difficile es capaz de inhibir la expresión de SLAMF1 en la superficie de los macrófagos, lo cual podría estar implicado en los resultados anteriores. Por último, observamos que los macrófagos forman puentes citoplasmáticos y agrupaciones de células en presencia de M. tuberculosis, lo que se interrumpe con el entrenamiento con C. difficile. Finalmente, se llevaron a cabo ensayos in vivo en un modelo murino de disbiosis y de infección primaria por C. difficile. Encontramos que la disbiosis intestinal promueve el daño en el ciego y el colon caracterizado por la infiltración mixta leucocitaria, la formación de nódulos linfáticos y edema de la submucosa. La CDI agravó la histopatología del colon durante la etapa aguda de la infección. Si bien los ratones se recuperaron y dejaron de presentar síntomas clínicos como diarrea luego de esta etapa, el daño a nivel intestinal se mantuvo y siempre fue mayor en el ciego. A nivel del pulmón, tanto la disbiosis intestinal como el establecimiento de la CDI inducen cambios estructurales. Observamos modificaciones en el área que ocupan los tabiques alveolares, la longitud de los tabiques, el número de ramificaciones, el tamaño de los alveolos y la complejidad del parénquima pulmonar. En conclusión, nuestros resultados demuestran la relevancia epidemiológica de la CDI en nuestra región y aportan información relevante para el estudio de esta infección en nuestro país. Por otro lado, nuestros resultados indican que tanto la disbiosis intestinal como la infección por C. difficile localizada en el intestino producen cambios en sitios distales como el pulmón y en los macrófagos, células especializadas en el reconocimiento de M. tuberculosis. Estos hallazgos destacan el papel del eje intestino-pulmón en el desarrollo de la CDI y de la Tuberculosis. Este trabajo nos permitió establecer un punto de partida a partir del cual podremos profundizar en las respuestas inmunes innatas, mecanismos celulares y mediadores implicados en el eje establecido por C. difficile y M. tuberculosis.