Participación del antiporter na+ /h+ nhx1 de lotus tenuis en la tolerancia a la salinidad de arabidopsis thaliana

Abstract

Lotus tenuis es una leguminosa forrajera perenne que se encuentra naturalizada en la Pampa Deprimida y se considera tolerante a la salinidad. La compartimentalización intracelular de Na+ en vacuolas mediante el antiporter NHX1 es una estrategia de las plantas para reducir la toxicidad iónica durante el estrés salino. Se conoce que la expresión modulada de NHX1 es clave en la tolerancia a salinidad de diversas especies, y que su expresión constitutiva en plantas transgénicas incrementa la tolerancia. El objetivo de este trabajo fue estudiar los cambios en la tolerancia a la salinidad de Arabidopsis thaliana a través de la expresión constitutiva de la región codificante del gen NHX1 de Lotus tenuis (LtNHX1). Para esto, se obtuvieron cinco líneas transgénicas de A. thaliana utilizando el método de inmersión floral con Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 portadora de la construcción 35S:cMyc-LtNHX1. La misma se había obtenido previamente por el grupo de trabajo de la UI UNNOBA-INTA mediante el subclonado de la región codificante de LtNHX1 en el vector pEarleyGate203, que permite su expresión constitutiva. Se seleccionaron las plántulas que expresaron el gen bar, marcador de selección que confiere resistencia al herbicida glufosinato de amonio. Se confirmó la presencia del transgén por PCR y se obtuvieron líneas homocigotas portadoras del evento de transformación. La expresión del transgén se confirmó por RT-PCR. Para evaluar la tolerancia a la salinidad durante la etapa vegetativa, las líneas transgénicas y el genotipo salvaje (Col 0) se analizaron en un DCA bajo tres tratamientos: 0 (control), 50 y 100 mM NaCl. A los 28 días se evaluó diámetro de planta (D, cm), peso fresco aéreo (PFA, mg), peso seco aéreo (PSA, mg), peso seco radicular (PSR, mg) y peso seco total (PST, mg) y se estimaron los índices de tolerancia del diámetro y del peso seco aéreo (ITD e ITPSA) a partir de la relación entre el valor de las plantas regadas con NaCl y el promedio del control. Además, se determinó el contenido de Na+ y K+ (µMoles g-1 peso seco) en muestras de hoja y raíz mediante fotometría de llama. Se realizó ANOVA de dos vías y test de comparaciones múltiples DGC. Cuatro de las líneas transgénicas 2 presentaron mayores ITD e ITPSA que Col 0. Se realizó un nuevo análisis comparativo entre una de las líneas transgénicas (28-13) y la Col 0, disminuyendo la variabilidad de los datos. La línea 28-13 presentó mayor ITD e ITPSA y se encontró interacción genotipo*tratamiento para PSA y D, con mayores medias de 28-13 en 100 mM NaCl. Además, la línea transgénica acumuló más Na+ en hoja. Un incremento de Na+ en las células podría causar toxicidad iónica y conducir a una grave inhibición del crecimiento. Sin embargo, se observó un mejor crecimiento de las plantas transgénicas en comparación con las wild-type bajo condiciones salinas, lo que podría ser consecuencia de la compartimentalización del exceso de Na+ en las vacuolas mediada por el antiporter NHX1 de Lotus tenuis. Dicha compartimentalización disminuiría los niveles tóxicos del ion en el citoplasma de las células de las hojas, incrementando la tolerancia tisular en las plantas transgénicas bajo estrés salino. Para evaluar la tolerancia a la salinidad en la germinación se sembraron semillas del tipo salvaje (Col 0) y de la generación T3 de tres de las líneas transgénicas en medio MS con 0 (control), 50, 100 y 150 mM NaCl. Se determinó el porcentaje de germinación (PG) respecto a las semillas sembradas al inicio del ensayo. La velocidad de germinación se estimó utilizando una modificación del índice de Timson: IG = G/t donde G es el porcentaje de semillas germinadas en distintos recuentos y t es el periodo total de germinación (11 días). Se realizó un ANOVA de dos vías y test de comparaciones múltiples DGC. Las líneas transgénicas presentaron mayores PG e IG en los tratamientos con 100 y 150 mM NaCl que Col 0, exhibiendo una mayor tolerancia al estrés salino. Estos resultados sugieren que la expresión constitutiva de LtNHX1 contribuye a incrementar la tolerancia a salinidad en la germinación. En estudios previos, la sobreexpresión de LtNHX1 había incrementado la tolerancia a la salinidad en etapa vegetativa de un genotipo transgénico de L. tenuis. En el presente trabajo, se confirmó el rol del antiporter NHX1 en la respuesta a dicho estrés abiótico en un sistema heterólogo como Arabidopsis thaliana, no solo en etapa vegetativa, sino también en germinación.