Infección por Clostridium Difficile: Inmunopatogénesis y disgnóstico molecular de una infección intrahospitalaria emergente

Abstract

La infección causada por Clostridium difficile es una de las principales causas de infecciones nosocomiales. C. difficile es una bacteria anaeróbica obligada, gram-positiva, formadora de esporas, es trasmitida a través de la vía fecal-oral y la sintomatología clínica va desde la colonización transitoria del intestino hasta la enfermedad fulminante. El aumento de la incidencia y la gravedad de la infección por C. difficile (CDI) ha llevado a una carga económica importante en los sistemas de salud debido a los costos asociados con el tratamiento y las estadías prolongadas de los pacientes en el hospital. Además del reciente incremento en la incidencia y gravedad de la enfermedad, la CDI tiene una alta tasa de recidiva clínica. La causa más común de susceptibilidad a la CDI son los antibióticos y la práctica estándar para el tratamiento de la CDI es el uso de antibióticos que producen una disrupción de la flora microbiana, creando un nicho para CDI adicionales. La CDI se diagnostica por la combinación de síntomas clínicos y una prueba de heces positiva para las toxinas de C. difficile o hallazgos endoscópicos o histológicos de colitis pseudomembranosa. Actualmente, el diagnóstico en nuestro país se realiza por Enzimoinmunoensayo (EIA), un test de alta especificidad pero baja sensibilidad. Teniendo en cuenta que: - el diagnóstico rápido y preciso de la CDI es esencial para el control nosocomial de la CDI. - existen muy pocos reportes en nuestro país acerca de la incidencia de la CDI y muy pocos reportes a nivel global acerca de la portación asintomática y del impacto de la misma en el desarrollo de la enfermedad. - el diagnóstico en nuestra región se realiza utilizando un método poco sensible. Uno de los objetivos del presente trabajo final de grado fue establecer un método de diagnóstico molecular para la detección rápida y sensible de C. difficile. En colaboración con personal del Hospital Interzonal de Agudos “Abraham Piñeyro”, se realizó la puesta a punto de una PCR directa de la toxina B para el diagnóstico de la CDI. La especificidad de los resultados se corroboró por comparación con muestras positivas cuyo diagnóstico había sido realizado por EIA. Asimismo, se comparó con un método molecular comercial, AmpliVue de Quidel, obteniendo también resultados positivos. En esta primera etapa hemos establecido la puesta a punto de la técnica y su implementación por personal del Hospital Regional de Junín. Los resultados obtenidos nos permiten sentar las bases para la futura validación del método de diagnóstico por PCR directa en un mayor número de muestras y su implementación como método de rutina en los centros de salud de la región. Por otro lado, el hecho de que la colonización asintomática persista sin ninguna manifestación de la enfermedad aparente sugiere que factores del hospedador como la respuesta inmune y la inflamación podrían tener un rol crítico en el desenlace de la enfermedad. La capacidad de C. difficile para causar colitis depende de los factores de virulencia, incluyendo toxinas, y factores de adherencia y su motilidad. Las toxinas A y B estimulan la liberación de citoquinas pro-inflamatorias (por ejemplo, IL-1, IFN-, TNF-, IL-8) a partir de células epiteliales y células inmunes residentes de las mucosas, lo que conduce a una destrucción adicional del revestimiento intestinal. Sin embargo, se conoce poco sobre el rol de las células T frente a la infección por C. difficile. La desregulación de subpoblaciones de células T está relacionada con la patogénesis del intestino en las enfermedades inflamatorias y en el cáncer. Así, otro de los objetivos del presente trabajo fue evaluar los mecanismos que median la generación de una respuesta inmune protectiva y aquellos que por el contrario podrían llevar a la inmunopatogénesis. Para esto, nos propusimos estudiar la respuesta inmune generada por C. difficile en Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP) de Dadores Sanos (DS) estimuladas con extractos de C. difficile inactivados por calor o con formol. Se observó que C. difficile regula positivamente la expresión de la molécula coestimulatoria SLAM y la producción de TNF-α en monocitos. Asimismo, se observó que las células THP-1 fagocitan a C. difficile y que SLAM podría tener una función moduladora en la activación de los monocitos/macrófagos en respuesta a C. difficile. Dado el carácter pro-inflamatorio de la infección por C. difficile, decidimos caracterizar la respuesta T y la producción de IFN- e IL-17. Los resultados obtenidos demuestran que C. difficile lleva a una regulación positiva del IFN-, y que más del 70% de las células productoras de citoquinas son doble positivas, productoras de IFN- e IL17. Esto podría sugerir una respuesta T Th1 y Th17 frente a la infección por C. difficile y una posible plasticidad Th1/Th17. Las moléculas coestimulatorias son esenciales en la activación T. Para continuar la caracterización de las respuesta T frente a C. difficile, se decidió estudiar la regulación de las moléculas coestimulatorias ICOS, SLAM y PD-1. Los resultados mostraron una modesta regulación de la expresión de SLAM y de PD-1 sólo en las células T estimuladas con C. difficile inactivado por tratamiento con formol, mientras que la expresión de ICOS no varió, tanto con C. difficile inactivado por calor como con el tratamiento con formol. Además, la estimulación con C. difficile inactivado con formol indujo un aumento de las células SLAM+IFN-+ y de las células PD-1+IFN-+, lo cual podría indicar que la bacteria es capaz de activar a las células T y que estas moléculas coestimulatorias podrían estar implicadas en la regulación del IFN- en la respuesta inmune frente a C. difficile. Conocer más sobre la respuesta inmune como también establecer un método de diagnóstico óptimo frente a la infección por C. difficile es necesario para prevenir brotes de la enfermedad, alcanzar un tratamiento eficaz y evitar recurrencias de la infección por C. difficile.