Edición génica de cdx2 en embriones bos taurus

Abstract

La edición génica en bovinos permite modificaciones genéticas precisas con aplicaciones múltiples, que van desde la mejora genética de los rasgos productivos hasta usos biomédicos. Los embriones bovinos son un modelo utilizado para estudiar los mecanismos fundamentales del desarrollo embrionario temprano ya que comparten muchas similitudes con los humanos y otros mamíferos. Además de generar información básica su importancia en la producción de alimentos justifica esfuerzos para mejorar su eficacia reproductiva. Un ejemplo de mejora es la corrección de las anomalías placentarias detectadas en los primeros embriones cultivados in vitro. La presencia de suero fetal bovino, rico en factores de crecimiento, genera cambios relativos en la transcripción de varios genes y provoca fenotipos anormales en el 25% de los fetos y neonatos producidos, que se engloban dentro del síndrome del ternero grande -(abreviado LOS del inglés, Large Offspring Syndrome). En los embriones de mamíferos, la primera diferenciación celular se da en la transición de mórula a blastocisto, cuando se forma el linaje trofectodermo (TE) y macizo celular interno (ICM), eventos celulares que ocurren en los primeros días post fecundación y están en los orígenes de las anomalías en el desarrollo embrionarios descriptas por LOS.

En las primeras etapas del desarrollo embrionarios el producto de los genes: Cdx2, Eomes, Sox2 y Gata3 resultan claves para la proliferación de TE y la implantación. En embriones bovinos, Cdx2 se expresa a partir de las 8 células y se localiza exclusivamente en TE, y aunque resultó no ser esencial para el establecimiento, si lo es para el mantenimiento. La modulación de la expresión de genes claves para el desarrollo embrionario preimplantatorio, como Cdx2, permitirá dirigir la primera diferenciación celular con el objetivo de mejorar el desarrollo del trofoectodermo, y finalmente, la placentación de los embriones. La modificación génica precisa de animales era difícil y requería tiempo prolongados, pero en los últimos años se han desarrollado nuevas herramientas para la edición génica, como CRISPR/CAS9.

El sistema CRISPR/Cas9 tiene la capacidad de reconocer la secuencia diana del DNA especifica a lo largo del genoma e inducir una ruptura de doble cadena en ese locus mediante dos dominios nucleasas presentes en la proteína CAS9. La principal ventaja del sistema es la posibilidad de editar diferentes secuencias de DNA cambiando la secuencia de 20nt del sgRNA, siendo la misma enzima CAS9 adecuada para todas las secuencias, haciendo así al sistema versátil y económico. En base a lo mencionado, el objetivo general de este trabajo fue estudiar el efecto del knock-out del gen Cdx2 a través de CRISPR/CAS9 en estadios preimplantatorios de embriones bovinos.

Con este fin, se diseñaron dos guías sobre el primer exón traducido de este gen, el cual contiene las secuencias que codifican los aminoácidos que conforman el sitio activo de la enzima. Esperamos que por la acción de CAS9 y estos guías se libere el fragmento interno, y se genere un alelo de pérdida de función, reconocible por la variación en la movilidad de un amplicón de esta región por PCR.

Las secuencias específicas de los guías fueron sintetizadas y clonadas en plásmidos que las exprese, pU6-sgRNA. Los plásmidos resultantes fueron corroborados por secuenciación. Estos plásmidos, junto al que expresa CAS9, fueron inyectados en embriones tempranos bovinos, y no se registraron variaciones en su desarrollo preimplantatorio ni en su calidad embrionaria. A pesar de tener dos pares de oligonucleótidos flanqueando la región editada, no conseguimos amplicones para evidenciar la edición.

Este trabajo presenta evidencia de que es factible, sencillo y económico la reconstrucción de guías específicos para una secuencia determinada lo que permite la obtención de knock-out utilizando el sistema CRISPR/Cas9 en cualquier especie animal. Este sistema puede permitir el estudio de las decisiones sobre el destino de las células embrionarias tempranas en embriones de mamíferos, así como también diseñar nuevas estrategias que pueden mejorar el desarrollo del trofectodermo.