ARN mensajeros como interruptores sintéticos para purificar células: Ensayos con el micro-ARN-Let7a para el desarrollo de terapias celulares en Diabetes.

Abstract

La Diabetes Tipo 1, es una de las enfermedades que más repercuten en la población mundial, y uno de los desafíos que se plantean para su abordaje es el desarrollo de terapias celulares mediante reprogramación celular hasta el fenotipo β pancreático para restituir la masa crítica de esa población en los pacientes. Sin embargo, las células reprogramadas resultantes presentan heterogeneidad, y los métodos de purificación no son eficaces. Intentando resolver esta problemática, Miki y col. (2015) desarrollaron un método de purificación que distingue y separa poblaciones celulares según la actividad de los microARN endógenos, que se denomina ARN interruptores sintéticos. El objetivo de este Trabajo Final de Grado fue diseñar, sintetizar y purificar poblaciones celulares que contengan el miR-Let7a, un microARN relacionado con las células β pancreáticas. Para ello las construcciones de ARN sintético se diseñaron y sintetizaron como ADN y se convirtieron en ARN mediante transcripción in vitro. Posteriormente en distintos ensayos se evaluaron su funcionalidad, especificidad y tolerancia. Por último se desarrolló un modelo de simulación de células reprogramadas para probar la purificación in vitro. Este proyecto pretende optimizar un método de purificación de células reprogramadas que alcance una eficiencia tal que permita aproximar los trasplantes celulares desde el laboratorio hasta los pacientes con Diabetes.

Type 1 Diabetes is one of the diseases that most affect the world population, and one of the challenges that arise for its approach is the development of cellular therapies by cell reprogramming to the pancreatic β phenotype to restore the critical mass of that population in patients. However, the resulting reprogrammed cell populations exhibit heterogeneity, and the purification methods are not effective. Trying to solve this problem, Miki et al. (2015) developed a purification method that distinguishes and separates cell populations according to the activity of endogenous microRNAs, which is called synthetic RNA switches. The objective of this Final Degree Project was to design, synthesize and purify cellular populations containing the miR-Let7a, a microRNA related to pancreatic β cells, to perfect the cellular purification technique by means of synthetic RNA switches, both in the design and synthesis of the constructions, in cellular populations that express miR-Let7a; and check them functionally in vitro. To this end, the synthetic RNA constructs were designed and synthesized as DNA and converted into RNA by in vitro transcription using a commercial kit. Subsequently in different assays we evaluated their functionality, specificity and tolerance in different cellular populations. Finally, we developed a simulation model of reprogrammed cells to test in vitro purification. This project aims to optimize a method of purifying reprogrammed cells that achieves an efficiency that allows approximation in cell transplants from the laboratory to insurance for patients with diabetes.