Infección por Clostridioides difficile: diagnóstico molecular y rol de la IL-17 en cultivos in vitro de órganos

Abstract

Clostridioides difficile (C. difficile), una bacteria anaeróbica gram positiva y formadora de esporas es reconocida como uno de los patógenos más importantes en los centros de salud. La capacidad de formar esporas induce mayores desafíos para reducir su transmisión debido a su resistencia. En los últimos años ha incrementado la incidencia global de la infección por C. difficile, así como la morbilidad y la mortalidad, y ha disminuido el éxito de los tratamientos1,2. Tanto la disrupción de la mucosa intestinal por las toxinas, el principal factor de virulencia de C. difficile, como la alteración de la flora intestinal por los antibióticos son centrales en la patogénesis de la infección por C. difficile (CDI). La CDI, es actualmente la principal causa de infección nosocomial en Estados Unidos, superando a Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA)3 . La principal forma de transmisión es la fecal-oral mediante el contacto persona-persona al traslado de C. difficile en las manos de los trabajadores de la salud4 . Sin embargo, la transmisión en individuos sanos colonizados asintomáticamente ha sido reportada, evidenciando así que los individuos asintomáticos constituyen un importante reservorio de la enfermedad1 . Además, es importante destacar que, aunque se considera una enfermedad nosocomial, los casos de CDI también han comenzado a surgir en la comunidad y en individuos que no presentan los factores de riesgo típicamente asociados a la CDI. Por otro lado, se ha observado un aumento significativo de la enfermedad en animales, señalando el potencial zoonótico, y la presencia de C. difficile en productos derivados y ambientes 5,6 . A diferencia de América del Norte y Europa, poco se conoce sobre la epidemiología en América Latina. Solo se dispone de escasos datos sobre la incidencia y la prevalencia de C. difficile como causa de diarrea en la Argentina7,8,9. Interesantemente, algunos trabajos demuestran que, al menos, el 15% de los casos de CDI fueron detectados en pacientes ambulatorios que presentaban diarrea, destacando el problema de la adquisición comunitaria de C. difficile9,10 . El diagnóstico de la CDI se realiza por la combinación de síntomas clínicos y un test positivo para las toxinas de C. difficile en materia fecal o hallazgos histológicos o endoscópicos de colitis pseudomembranosa. Existe una gran diversidad de test disponibles, incluyendo PCR para los genes de las toxinas A y B, enzimoinmunoensayo (EIA) para la glutamato deshidrogenasa (GDH) de C. difficile y las toxinas A y B, cultivo toxigénico y ensayo de citotoxicidad celular. Actualmente, el test más utilizado en 9 Argentina es el EIA. Si bien este es un método sencillo y de alta especificidad posee una baja sensibilidad. La manera más sencilla para diagnosticar la CDI sería mediante un único test rápido capaz de predecir el estatus de la enfermedad. Sin embargo, como ha sido reportado por Crobach y colaboradores, se propone la utilización de al menos dos test 11, lo cual reduciría el porcentaje de falsos positivos. Debido a esto, uno de los objetivos de este trabajo fue poner a punto una PCR directa a partir de materia fecal, sin necesidad previa de extracción y purificación de ADN. La evaluación de parámetros de calidad de la PCR directa arrojó una alta sensibilidad y especificidad, así como valores confiables de PPV (valor predictivo positivo) y NPV (valor predictivo negativo). Por otro lado, combinando el EIA, el cultivo toxigénico y la PCR directa, realizamos un análisis retrospectivo y prospectivo de muestras de materia fecal obtenidas de centros de salud de la región sanitaria III. De las 97 muestras analizadas, 27 fueron positivas mientras que 66 fueron negativas para la CDI, lo que indica un porcentaje del 27.83% de CDI intra-hospitalaria. La implementación de la PCR directa de materia fecal en los centros de salud, permitiría no solo un diagnóstico más acelerado, barato y preciso, sino que adicionalmente ayudaría al conocimiento de la epidemiologia de la CDI en nuestro país. Además, se analizaron características sociodemográficas, parámetros clínicos y factores de riesgo asociados a la CDI, como el consumo de antibióticos, inhibidores de la bomba de protones y la presencia de comorbilidades. Únicamente se observaron diferencias significativas en el número de leucocitos y linfocitos entre los pacientes CDI+ y CDIsiendo mayores en pacientes colonizados con C. difficile. A pesar de la caracterización temprana de C. difficile en 1935, esta bacteria ha emergido como un asunto sanitario urgente en los últimos años. La interacción entre C. difficile y el sistema inmune del hospedador, como así también la composición de la microflora intestinal, pueden influir en la gravedad de la infección. La patogénesis de la CDI es mediada principalmente por la producción de toxinas que inducen daño tisular y procesos inflamatorios en el hospedador. Si bien la inmunidad innata se encuentra bien caracterizada en modelos humanos y animales de CDI, las respuestas adaptativas permanecen poco exploradas12 . Teniendo en cuenta estos antecedentes, otro de los objetivos del presente trabajo fue caracterizar la respuesta inmune frente a C. difficile utilizando un modelo de cultivo in vitro de tejido. El cultivo in vitro de órganos ha mostrado ser muy útil para estudios que 10 implican agentes infecciosos13,14. y nos permitiría lograr una mejor comprensión de la función de la IL-17 durante la CDI. Los resultados preliminares, nos indican que, podría existir una modulación en la expresión de IL-17, tras desafiar a los tejidos con distintos estímulos de C. difficile. Al mismo tiempo, hemos observado una tendencia al aumento de la expresión de IL-4 e IL-10 luego del desafío con el mismo estimulo. Adicionalmente, luego de estimular los tejidos con C. difficile teñida con FITC hemos podido observar la bacteria tanto en la región submucosa como en la mucosa del intestino grueso. Posteriormente, hemos podido observar que; cuando los tejidos eran desafiados con C. difficile inactivada por calor había una tendencia al aumento en el número de células CD3+ IL-17+ y lo mismo ocurría con el número de células CD3- IL-17+ .